06_845

Diversidad genética en humanos mediante polimorfismos de inserción de Alu en la población de San Pelayo, Córdoba (Colombia)

Genetic diversity in humans through Alu insertion polymorphisms in
the population of San Pelayo, Córdoba- Colombia

Diversidade genética em humanos através de polimorfismos de inserção de Alu
na população de San Pelayo, Córdoba- Colombia

Enrique Pardo Péreza,* | Teodora Inés Cavadía Martínezb | Andrea Estefanía Cruz Canteroc

a http://orcid.org/0000-0002-6467-5790

b http://orcid.org/0000-0002-3553-6046

c http://orcid.org/0000-0001-5717-4712

Universidad de Córdoba, Montería, Colombia

Resumen

Esta investigación determinó la diversidad genética y la estructura poblacional en poblaciones humanas de San Pelayo, a partir de polimorfismo Alu humano. Las muestras se obtuvieron de adultos no emparentados. El ADN de cada muestra fue extraído mediante el kit de Promega, los marcadores se amplificaron mediante PCR y los amplificados fueron sometidos a electroforesis y visualizados en un transiluminador. Los loci resultaron polimórficos, las frecuencias alélicas mostraron valores heterogéneos. La prueba de Hardy Weinberg indicó que la población no estaba en equilibrio. También se detectó baja heterocigosidad y alto índice de fijación y los marcadores utilizados resultaron apropiados para la evaluación de la diversidad genética. La población presentó baja diversidad y alto nivel polimórfico.

Palabras clave: Alu, diversidad genética, polimorfismo, heterocigosidad

Summary

This research determined the genetic diversity and population structure in human populations in San Pelayo, based on human Alu polymorphism. The samples were obtained from unrelated adults. The DNA of each sample was extracted using the PROMEGA kit, the markers were amplified by PCR and the amplified ones were subjected to electrophoresis and visualized in a transilluminator. The loci were polymorphic, the allelic frequencies showed heterogeneous values. The Hardy Weinberg test indicated that the population was not in equilibrium. Low heterozygosis and a high fixation index were also detected and the markers used were appropriate for the evaluation of genetic diversity. The population showed low diversity and a high polymorphic level.

Keywords: Alu, genetic diversity, polymorphism, heterozygosis

Sumário

Esta pesquisa determinou a diversidade genética e a estrutura populacional em populações humanas, em San Pelayo, a partir do polimorfismo Alu humano. As amostras foram obtidas de adultos não aparentados. O DNA de cada amostra foi extraído com o kit PROMEGA, os marcadores foram amplificados por PCR e submetidos a eletroforese e visualizados em um transiluminador. Os loci eram polimórficos, as frequências alélicas apresentaram valores heterogêneos. O teste de Hardy Weinberg indicou que a população não estava em equilíbrio. Também foram detectados uma baixa heterozigosidade e um alto índice de fixação e os marcadores utilizados foram adequados para a avaliação da diversidade genética. A população apresentou uma baixa diversidade e um alto nível polimórfico.

Palavras-chave: Alu, diversidade genética, polimorfismo, heterozigosidade

Los elementos móviles pueden constituir aproximadamente el 45% del genoma humano. Entre ellos el grupo más abundante lo compone la familia de elementos Alu. Las inserciones de Alu son marcadores bialélicos que se definen por la ausencia y presencia de unas secuencias
de aproximadamente 300 pb, que con unas variaciones más o menos importantes derivan del gen 7SL RNA, el cual forma parte del complejo ribosomal por retrotransposición. Son especialmente interesantes en antropogénica
por aparecer hace 65 millones de años y encontrarse con el origen y la expansión de los primates (Batzer & Deininger, 2002). La mayoría de las inserciones Alu son recientes, por lo que en general son polimórficas, pudiendo tomar diferentes valores de frecuencias en distintas
poblaciones humanas (Stoneking et al., 1997). Es altamente improbable que la misma inserción Alu ocurra dos veces independientemente en el mismo lugar, por lo que se consideran eventos mutacionales únicos (Batzer & Deininger, 1994). A nivel mundial se han hecho diferentes reportes de los elementos Alu en diferentes poblaciones, Novick et al.
(1998) comparó cinco inserciones Alu en treinta poblaciones de las cuales veinticuatro fueron del continente americano y seis de otras partes del mundo, reportando que las relaciones entre las poblaciones tenían una correlación con la distribución geográfica dentro del continente americano, lo que confirma la sensibilidad con que los marcadores Alu permiten comparar y asociar poblaciones. En Colombia, factores geográficos, climáticos e históricos han contribuido a los patrones de variación genética humana vistos en la actualidad y a nivel mundial. Por ejemplo, los procesos de población asociados a la colonización, los periodos de aislamiento geográfico, la endogamia socialmente reforzada y la selección natural todos han afectado las frecuencias de alelos en ciertas poblaciones (Jorde, Bamshad & Rogers, 1998; Jorde & Wooding, 2004). Sin embargo, la actualidad de nuestra ascendencia común y el flujo continuo de genes entre los grupos humanos han
limitado la diferenciación genética en nuestra especie (Jorde & Wooding, 2004).

Las poblaciones del Caribe colombiano se caracterizan por ser híbridas o mezcladas, se tiene un aporte genético particular de los diferentes grupos amerindios, indígenas, afrodescendientes y europeos llegados de España y
Portugal que conforman cada una de las poblaciones de Colombia (Gutiérrez, 1980). Tanto en Colombia como en el departamento de Córdoba se presenta un alto mestizaje
y se desconoce su diversidad genética aún más en trabajos relacionados con los elementos Alu, con excepción del reporte de las estimaciones de mezclas genéticas por elementos Alu en poblaciones afrocolombianas y mestizas
en Antioquia, donde se determinaron los procesos de mezclas que ocurren en las poblaciones de América Latina
al examinar los perfiles genéticos de dos grupos étnicos de Antioquia (Gómez et al. 2010). En el municipio de San Pelayo hay un gran mestizaje, debido a la colonización de extranjeros españoles, mestizos, blancos y negros. Sin embargo, en este municipio ha aparecido en muchas generaciones el cruzamiento entre familias, lo que hay traído un problema que afecta como tal el deterioro de la diversidad genética en las próximas generaciones. Por lo tanto, en esta investigación se determinó la diversidad genética y la estructura poblacional en humanos de San Pelayo, utilizando cinco polimorfismos de inserción Alu.

Materiales y métodos

Área de estudio. Las 40 muestras fueron colectadas así: 20 en la subpoblación San-Pelayo Urbano (8° 57’ 28’’ N, 75° 50’ 15’’ O) y 20 en Sabana-Nueva (8° 58’ 1’’N, 75° 51’ 0’’ W) en el departamento de Córdoba, Colombia.

Obtención de muestras. Las muestras requeridas para el análisis genético se obtuvieron de adultos voluntarios no emparentados entre sí, residentes estables de la población del estudio, desde al menos tres generaciones. Se recolectaron 2 ml de saliva por cada individuo en dos
tubos eppendorf de 1,5 ml, después se adicionó solución de lisis celular 500 µl; los participantes en el estudio
firmaron el respectivo consentimiento informado. Posteriormente, las muestras fueron almacenadas en una cava con una temperatura de 4° C para ser trasladadas hasta el laboratorio de genética de la Universidad de Córdoba.

Aspectos éticos. Este trabajo cuenta con la aprobación del comité de ética para investigación en humanos de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Córdoba.

Extracción de ADN. Para la extracción de las 40 muestras de ADN se utilizó el kit de extracción y purificación de Wizard Genomic DNA Purification (Promega) y se siguieron las recomendaciones del fabricante sin modificaciones. La pureza y la concentración del ADN fue determinada utilizando 1 µL de la muestra en un espectrofotómetro Nanodrop 2000® (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con relaciones de absorbancia A260/A280 nm y A260/A230 nm. La integridad del ADN se determinó de manera visual mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.0%, con un voltaje de 120 V por 2 h en buffer TBE 1X (Tris-HC1 500 mM, ácido bórico 60 mM y EDTA 83 mM) y agente de tinción GelRed 1X. El gel se visualizó en un transiluminador Bio-Imagen System 312 nm, Neve Yamin, Israel.

Amplificación por PCR. Los cebadores Alu: D1 (Batzer et al., 1995), FXIII, APO y PV92 (Batzer et al., 1994) y ACE (Tired et al., 1992) se observan en la tabla 1, fueron amplificados mediante la técnica de la PCR.

La técnica de la PCR (tabla 2) se realizó en un volumen total de 25 μl que contenía 0,25 μl de Taq polimerasa (Thermo Scientific) (Uklam-EE. UU.), 1,25 μl de cada primer (forward y reverse), 0,5 μl de dNTPs a 10 mM /μl, 2,5 μl de buffer de reacción a 10X, 1,25 μl de MgCl2, 5 μl de ADN y agua estéril hasta alcanzar el volumen final. La reacción de PCR se realizó en un termociclador Bioard T100 (Los Ángeles, EE. UU.) mediante la técnica PCR Tochdown.

Tabla 2. Ciclos PCR realizados para la amplificación de 5 inserciones Alu

Temperatura	Tiempo	Número de ciclos
95°	1-3 min.	1
95°	30 seg.	39
52°-65°	30 seg.
72°	1 min.
72°	5-15 min.	1

Visualización y cuantificación del ADN. Los amplificados de la PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 2%, a 100 voltios durante 40 minutos, estos resultados fueron visualizados bajo luz ultravioleta en una cámara de
(Cleaver Scientific) (Londres, UK). Además, en el gel
de agarosa se añadió un marcador de peso molecular de separación 500 pb, con el objeto de identificar el tamaño de las bandas de la PCR (figura 1).

Análisis estadístico. Para la determinación de los parámetros de diversidad genética: frecuencias alélicas, heterocigosidad observada y esperada, equilibrio de Hardy-Weinberg, y estadísticos F de Wright se utilizó el software GenAlex 6.502 (Peakall & Smouse, 2012).

Resultados

En la figura 1 se puede observar la electroforesis de 38 muestras para el cebador ACE (Pb 490/190), donde se pueden observar homocigotos con la inserción: individuos 1,8, 13, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 30,31, 34, 35, heterocigotos: individuos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 18, 19, 24, 26, 28 y homocigotos sin inserción: individuos 9, 10, 11, 23, 27, 32, 33.

En la tabla 3 se observan los valores de las frecuencias alélicas obtenidas para los marcadores Alu, en las dos subpoblaciones estudiadas, todos los loci analizados resultaron polimórficos. Al determinar las frecuencias alélicas para cada subpoblación (tabla 3) se obtuvo que para San Pelayo urbano y Sabana-Nueva, las inserciones D1, PV92 y APO muestran los mayores valores y las menores frecuencias se encontraron para los marcadores ACE y FXIII respectivamente. La frecuencia alélica promedio resultó mayor en San Pelayo Urbano (0,425) que en Sabana-Nueva (0,324).

Tabla 3. Frecuencias alélicas de 5 marcadores Alu

Loci	Alelo	San-Pelayo Urbano	Sabana-Nueva
ACE	490	0,125	0,375
APO	409	0,500	0,521
D1	670	0,636	0,227
FXIII	700	0,231	0,200
PV92	443	0,636	0,300
Promedio	542,4	0,425	0,324

En la tabla 4 los valores obtenidos para el equilibrio de Hardy-Weinberg en las dos subpoblaciones mostraron ausencia de valores equilibrio de Hardy-Weinberg
(p < 0,05) para los cinco loci analizados. La heterocigosidad observada (Ho) mostró valores entre 0,042 y 0,000. Los valores de heterocigosidad esperada (He) varían entre 0,219 para la subpoblación de San Pelayo Urbano hasta 0,500 y para la subpoblación de Sabana-Nueva se observaron valores de 0,320 y 0,499. El índice de fijación indica un valor de 1,000 en la subpoblación de San-Pelayo urbano en general, pero en la subpoblación de Sabana-Nueva solo el loci APO tuvo un valor de 0,917.

Tabla 4. Parámetros genéticos calculados en la zona de estudio

Población	Loci	P	Ho	He	F
San Pelayo Urbano	ACE	0,005**	0,000	0,219	1,000
	APO	0,000***	0,000	0,500	1,000
	D1	0,001**	0,000	0,463	1,000
	FXIII	0,000***	0,000	0,355	1,000
	PV92	0,001**	0,000	0,463	1,000
Sabana-Nueva	ACE	0,000***	0,000	0,469	1,000
	APO	0,000***	0,042	0,499	0,917
	D1	0,000***	0,000	0,351	1,000
	FXIII	0,000***	0,000	0,320	1,000
	PV92	0,000***	0,000	0,420	1,000

P: equilibrio Hardy-Weinberg (** p < 0,01, *** p < 0,001), Ho: heterocigosidad observada, He: heterocigosidad esperada, F: índice de fijación

En la tabla 5 los valores de FST varían de 0,00 en el marcador APO a 0,17 para el locus D1. En el caso de las FIS y FIT mostraron valores de 0,958 a 1,000.

Tabla 5. Valores de los estadísticos F para cada marcador en la población global

	FST	FIT	FIS
ACE	0,083	1,000	1,000
APO	0,000	0,958	0,958
D1	0,171	1,000	1,000
FXIII	0,001	1,000	1,000
PV92	0,114	1,000	1,000
Promedio	0,074	0,992	0,992

Discusión

Los cinco marcadores analizados resultaron polimórficos en las dos subpoblaciones, las inserciones Alu mostraron valores heterogéneos dentro del rango de las frecuencias alélicas. Se observa una afinidad con las frecuencias alélicas de las poblaciones europea-americana, y la africana-americana (Watkins et al., 2001). Los valores promedios de las frecuencias alélicas de San Pelayo Urbano fueron más cercanos a las reportadas en Rongmei, Inpui y Kuki y las de Sabana Nueva a las de Zeme Liangmai (Kshatriyaa, Panmeib & Kameihc, 2019).

La heterocigosidad observada (Ho) presentó valores bajos en comparación con lo reportado para las poblaciones de América y de otros lugares del mundo (Stoneking et al., 1997) lo cual pudo ser ocasionado por la endogamia. Los valores de la heterocigosidad esperada (He) fueron superiores debido a la homogeneidad de las frecuencias alélicas en los marcadores, por tanto, lo que se espera en la siguiente generación es un número de homocigoto mucho más altos que de heterocigotos, estos resultados de heterocigosidad esperada se asemejan a lo reportado para las poblaciones amerindias, las poblaciones africanas y las poblaciones asiáticas (Antúnez et al., 2002; Battilana et al., 2006).

Los cinco marcadores no estuvieron en equilibrio de
Hardy-Weinberg para las subpoblaciones, esto pudo
deberse a diferentes eventos como el efecto Wahlund,
suceso que no afecta por igual a todo el genoma y produce un aumento de homocigotos y una disminución de heterocigotos, lo cual está en concordancia con los
resultados obtenidos y también por la endogamia originada por un aislamiento de las dos subpoblaciones: en la historia de San Pelayo, durante el proceso de colonización entre los años 1690 y 1721, se reporta que las familias del municipio se casaban entre ellas (Fortich, 2014) y para
el caso de Sabana Nueva en su reseña histórica se afirma que esta fue fundada por españoles que llegaron vía fluvial a finales del siglo XVIII, donde al igual que en San Pelayo, predominó un entrecruzamiento entre las familias fundadoras para poder mantener su abolengo en las siguientes generaciones, por esto es común encontrar apellidos que predominan como Petro, Hernández, Doria y Cantero,
considerados en los estudios antropológicos como
los primeros pobladores de esta localidad y determinantes para el predominio del color de piel de estos pobladores (Fortich, 2014). La ausencia del equilibrio de Hardy Weinberg obtenida en esta investigación, fue similar a los resultados reportados en poblaciones amerindias colombianas para marcadores Alu (Novick et al., 1998).

Los valores obtenidos para el índice de fijación mostraron que las dos subpoblaciones presentaron un aislamiento genético. Respecto a los estadísticos F se observó que en
los valores de FST mostraron valores cercanos a cero
en casi todos los marcadores, indicando que las dos subpoblaciones se comportan como una sola población; estos resultados son menores a lo reportado en poblaciones de Europa, África y afrocolombianas (Gómez et al., 2010, Terreros et al., 2009). Además, la diversidad genética
obtenida en el presente estudio puede atribuirse a
variaciones individuales dentro de las poblaciones, ya que solo el 7,4% de la diversidad genética total proviene de la variación entre las poblaciones (FST).

Al mismo tiempo, las FIS Y FIT ratifican el déficit de
heterocigoto, estos resultados se dan por consecuencia de apareamientos consanguíneos. Estos valores obtenidos no poseen similitud con las poblaciones brasileñas
(Cotrim et al., 2004).

Conclusiones

La población de San Pelayo, Córdoba (Colombia) presentó una baja diversidad genética, y un alto nivel polimórfico en todos los elementos Alu. El exceso de homocigotos que hay en toda la población es producido por la endogamia, lo cual aumenta la posibilidad de pérdida de los alelos para las siguientes generaciones, en consecuencia, esto llevaría a la disminución de la diversidad genética a lo largo del tiempo.

Referencias

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Locus	LC	SF	Secuencia (5’- 3’)	T°C	Tamaño del fragmento (pb)
ACE	17q23	Ya5	F: CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT R: GATGTGGCCATCACATTCTCAGAT	58	490/190
PV92	16q23.3	Ya5/Ya8	F: AACTGGGAAAATTTGAAGAGAAAGT R: TGAGTTCTCAACTCCTGTGTGTTAG	54	437-122
APO	11q23.3	Ya5	F: AAGTGCTGTAGGCCATTTAGATTAG R: AGTCTTCGATGACAGCGTATCAGA	52	443/129
FXIII	1q31-q32.1	Ya5	F: TCAACTCCATGAGATTTTCAGAAGT R: CTGGAAAAAATGTATTCAGGTGAGT	56	700-410
D1	3q26.32	Yb8	F: TGCTGATGCCCAGGGTTAGTAAA R: TTTCTGCTATGCTCTTCCCTCTC	65	670/333